U genomu bakterija geni su organizirani u operone. Operon čini više susjednih gena pod zajedničkom transkripcijskom kontrolom istog promotora i operatora.
Jedan od najbolje proučenih primjera regulacije ekspresije gena u prokariota je Lac-operon (otkrili Jacob i Monod kod bakterije E. coli, 1961.; 1965. Nobelova nagrada za otkriće).
Lac-operon je inducibilni sustav regulacije. Naime stanica proizvodi enzime za razgradnju šećera laktoze (lac) samo ako je taj izvor ugljika prisutan u okolišu bakterije (laktoza je induktor).
VAŽNO JE ZNATI
Inducibilni enzimi se sintetiziraju samo kada je u okolišu prisutan njihov supstrat.
E. coli može koristiti laktozu kao izvor energije zahvaljujući genima Lac-operona. Geni Lac-operona smješteni su jedan iza drugoga na bakterijskom kromosomu i imaju zajedničku regulaciju ekspresije (slika 15.1.). Lac-operon čine tri strukturna gena lacZ, lacY i lacA za tri enzima: β-galaktozidazu, β-galaktozid permeazu i β-galaktozid acetiltransferazu, koji sudjeluju u metabolizmu šećera laktoze. Laktoza je disaharid, odnosno beta-galaktozid. Nakon cijepanja laktoze na glukozu i galaktozu, bakterija koristi glukozu kao izvor ugljika i energije.
Enzim koji cijepa laktozu na dva monosaharida je β-galaktozidaza; taj enzim također može pretvarati laktozu u alolaktozu (slika 15.2.) koja je induktor. Sintezu β-galaktozidaze kodira bakterijski gen lacZ. Kada započne sinteza β-galaktozidaze (gen je induciran), inducira se sinteza još dva enzima: β-galaktozid permeaze (kodira gen lacY) i β-galaktozid acetiltransferaze (gen lacA). Permeaza je potrebna za transport laktoze u stanicu, dok transferaza štiti stanicu od nastanka toksičnih produkata koje stvara β-galaktozidaza kada djeluje na druge galaktozide tj. šećere (acetiliranje).
Lac-geni (z, y i a) ne samo da se induciraju zajedno, već budući da su smješteni jedan do drugoga transkribiraju se u jednu, policistronsku mRNA (slika 15.1.). Indukcija ovih gena zahtijeva aktivnost jednog drugog gena kojega nazivamo gen regulator (lacI). Gen regulator smješten je uzvodno od gena z, y i a, no njegova je transkripcijska aktivnost neovisna o njima. Kodira za represorski protein, koji utječe na ekspresiju gena uključenih u metabolizam laktoze.
Slika 15.1. Geni Lac operona transkribiraju se u jednu policistronsku mRNA; aktivnost gena regulira gen regulator (i) smješten uzvodno (crtež Renata Horvat).
Slika 15.2. Beta-galaktozidaza cijepa laktozu na galaktozu i glukozu (a) i pretvara laktozu u alolaktozu (b).
Da bi represorski protein mogao regulirati aktivnost strukturnih gena (z, y i a) mora postojati kontrolni element ili receptorsko mjesto koje se nalazi uzvodno od gena za β-galaktozidazu. Kontrolni element je regija koju nazivamo operator ili operatorsko mjesto, a radi se o sekvenciji DNA na koju se veže represorski protein (slika 15.3.). Ako je na operatorskom mjestu vezan represorski protein to spriječava transkripciju strukturnih gena. Ako je operatorsko mjesto slobodno, transkripcija strukturnih gena se odvija.
Promotorsko mjesto je sekvencija za koju se veže enzim RNA-polimeraza te započinje transkripciju strukturnih gena. U odsustvu laktoze razina β-galaktozidaze u stanici je minimalna, a u prisustvu laktoze ona značajno poraste (najmanje 1000 puta) te se inducira prvi strukturni gen lac-operona lacZ. Nakon toga se induciraju i druga dva strukturna gena (slika 15.3.). U odsustvu laktoze represorski protein koči transkripciju lac-operona jer je vezan za operator i tako onemogućava transkripciju RNA-polimerazi koja je vezana za promotor.
Indukcija lac-operona postiže se inaktiviranjem represora vezanjem alolaktoze (induktor) za represor. Vezanjem alolaktoze za represor dolazi do strukturne promjene represora (alosterički protein) te se smanjuje njegov afinitet za operatorsku regiju DNA oko 1000 puta.
Slika 15.3. U odsustvu laktoze represor je vezan za operator te nema transkripcije lac gena (gore). U prisustvu laktoze (dolje) represor se miče sa operatora jer se na njega veže alolaktoza, transkripcija gena započinje (crtež Renata Horvat).
Mutante strukturnih gena operona z–, y– i a– ne proizvode enzime normalne funkcije. Istraživanja parcijalnih diploda za strukturne gene pokazala su da je divlji tip z+, y+, a+ jači od mutanata.
Defektni represor i– je mutacija gena i čiji produkt ne funkcionira kao normalni represor. To znači da se takav represor ne može vezati na operator i stoga su svi strukturni geni aktivni. Istraživanja parcijalnih diploida u E. coli pokazala su da je divlji tip gena i jači od mutante i–. Postoji još jedna mutacija i-gena koja je jača od divljeg tipa. To je super-represorska mutanta iS . Super-represor je stalno vezan na operator pa su prema tome trajno inaktivirani svi strukturni geni tj. nema sinteze enzima.
Mutanta operatorskog gena je oc je trajno otvoreni ili konstitutivni operator što znači da se sinteza enzima stalno odvija bez obzira na laktozu. To je neregulirana, konstitutivna sinteza. Istraživanja parcijalnih diploida za gen o pokazala su da je mutanta oc jača od divljeg tipa o+.
VAŽNO JE ZNATI
Konstitutivne mutante su mutante kod kojih su sva tri strukturna gena stalno aktivna tj. stalno se sintetiziraju enzimi bez obzira da li je induktor, laktoza prisutna u okolišu.
Lac-OPERON: POZITIVNA REGULACIJA ili KATABOLITNA REPRESIJA
Lac-operon i neki drugi operoni koji razgrađuju šećere u bakteriji E. coli mogu biti inhibirani prisutnošću glukoze koju E. coli prioritetno koristi. Za to je ključni protein CAP – katabolitički aktivatorski protein te ciklički-AMP (adenozin-monofosfat), cAMP. U odsustvu glukoze cAMP i CAP su u kompleksu koji se veže za CAP-mjesto lac promotora, pri tome izaziva zakrivljenje DNA te značajno povećava afinitet RNA-polimeraze za promotor te se transkripcija pojačava (slike 15.4.).
U prisustvu glukoze nema cAMP-a (glukoza inhibira enzim adenilciklazu koja katalizira hidrolizu ATP u cAMP), niti cAMP-CAP kompleksa te je transkripcija Lac-operona značajno smanjena u prisustvu laktoze (slika 15.4.). Kompleks cAMP-CAP djeluje kao pozitivna kontrola transkripcije, za razliku od represora koji je uključen u negativnu kontrolu.
Lac-operon je prema tome pod dvostrukom kontrolom: negativnom kontrolom represora i pozitivnom kontrolom kompleksa cAMP-CAP.
Slika 15.4. Pozitivna regulacija kompleksom cAMP-CAP (u odsustvu glukoze). Ako je repressor vezan za operator čak i u prisustvu kompleksa cAMP-CAP nema transkripcije (crtež Renata Horvat).
Trp-operon: represivni sustav regulacije
Bakterija E. coli sintetizira triptofan iz prekursora u nekoliko koraka, a svaki korak katalizira specifični enzim. Pet gena kodira sintezu pet enzima potrebnih za sintezu triptofana, ti su geni smješteni jedan iza drugoga na DNA i čine Trp-operon. Aktivnost tih gena regulirana je na istom mjestu koje čini promotorska i operatorska sekvencija.
Slika 15.5. Trp-operon – regulacija krajnjim produktom (engl. feedback) (crtež Renata Horvat).
Kada je triptofan prisutan u stanici u suvišku, veže se za inaktivni trp-represorski protein i aktivira ga. Aktivirani represor veže se za operatorsku regiju i inhibira transkripciju Trp-operona (slika 15.5.). U ovom slučaju triptofan djeluje kao korepresor.
Ukoliko u stanici nema triptofana, represor je inaktivan, operatorsko mjesto je slobodno te se induciraju svi geni za enzime biosintetskog puta triptofana (slika 15.5.).
Trp-operon je također reguliran i mehanizmom koji nazivamo prigušivanje ili atenuacija (Yanofski) u kojem transkripcija započinje ali prerano završava odnosno prigušuje se. Za to je zadužena sekvencija koja je regulirana genom trpL koji se nalazi iza operatora. Ako je količina triptofana u stanici velika osim represora uključuje se i mehanizam prigušivanja u kojemu transkripcija RNA-polimerazom od promotora završava s trpL genom.