Molekularni mehanizam replikacije

Iako je Watson-Crickov koncept semikonzervativne replikacije vrlo jednostavan, molekularni mehanizam je zapravo vrlo složen i ovisi o molekularnoj mašineriji stanice koja uključuje različite enzime i utrošak energije.  Replikacija DNA se ne događa spontano već je dio kontroliranog staničnog ciklusa. Replikacija ima dva bazična koraka, inicijaciju i elongaciju.

Glavni enzim replikacije je DNA-polimeraza III.

Replikacija prokariotske DNA započinje na jednom mjestu prokariotskog kromosoma dok u eukariotskim kromosomima replikacija počinje na više mjesta. Primjerice čovjekov genom (3×10⁹ pb) ima oko 100.000 izvora replikacije kako bi se čitav genom replicirao u odgovarajućem vremenu S-faze staničnog ciklusa (oko 8 sati).

Inicijacija je proces odmatanja lanaca dvostruke uzvojnice u kojem sudjeluju dva proteina: inicijacijski protein i enzim helikaza (slika 10.9. a. i b.). Helikaza katalizira odmatanje lanaca dvostruke uzvojnice te tada svaki  lanac služi kao kalup za sintezu novog komplementarnog lanca.

Odmatanje dvostruke uzvojnice započinje na posebnoj kratkoj sekvenciji nukleotida koju nazivamo izvor replikacije ili ori-mjesto (engl. origin of replication). Nakon odvajanja lanaca nastaju dvije replikacijske vilice ili Y-regije, koje formiraju replikacijski mjehurić (engl. replication bubble) (slika 10.9. b.).

Kako bi DNA-kalup bio u  jednolančanom obliku potrebno je formiranje replikacijskog mjehurića kojega čine dvije replikacijske vilice. Budući da DNA-polimeraza ne može sintetizirati novi lanac iz ničega (de novo) mora imati sintetiziranu malu RNA-molekulu (oko 10 nukleotida) koju nazivamo početnica (engl. primer). RNA-početnicu čini nekoliko RNA-nukleotida, a za njenu sintezu je odgovoran enzim primaza. Primaza sintetizira početnicu, na replikacijskoj vilici, koja se sparuje sa komplementarnim bazama jednolančanog DNA-kalupa.

Nakon inicijacije slijedi elongacija. Započinje dodavanjem jednog deoksiribonukleotida na slobodni 3′-OH kraj RNA-početnice te se nastavlja dodavanje ostalih deoksiribonukleotida na temelju komplementarnosti baza lanca kalupa. Baza adenin sparuje se s komplementarnom bazom timinom sa dvije vodikove veze, a baza citozin s bazom gvaninom sa tri vodikove veze. Elongaciju katalizira enzim DNA-polimeraza III.

Enzim DNA polimeraza: može kopirati samo odmotanu, jednolančanu DNA; može dodavati nukleotide samo na kraj već postojećeg lanca (što znači da ne može započeti sintezu lanca de novo) i uvijek djeluje u smjeru 5′-3′ (što znači da nove nukleotide dodaje na slobodan 3′-OH kraj zadnjeg nukleotida).

Budući da je molekula DNA originalno dvostruka uzvojnica koju čine dva antiparalelna polinukleotidna lanca, tijekom replikacije razlikujemo vodeći (engl. leading strand) i zaostajući lanac (engl. lagging strand). Vodeći lanac ima smjer 5’-3’ te se njegova sinteza odvija kontinuirano (Slika 10.9.a).

Drugi lanac je zaostajući lanac jer je zbog orijentacije lanca kalupa (3′-5′) replikacija diskontinuirana. Na lancu smjera 3′-5′, DNA-polimeraza sintetizira kratke fragmente (eukarioti: 100-200 nukleotida; bakterije 1000-2000) koje nazivamo Okazakijevim fragmentima i dodaje ih na slobodni 3’OH-kraj svake početnice. Na kraju replikacije enzim DNA-polimeraza I izreže početnice i nadomjesti ih sa deoksiribonukleotidima, a ligaza poveže Okazakijeve fragmente u kontinuirani lanac.

Tijekom replikacije helikaza stalno odmata dvolančanu uzvojnicu kako bi nastale jednolančane regije na kojima dolazi do sinteze novih lanaca DNA. Da bi se očuvalo jednolančano stanje tih regija, potrebni su enzimi koji stabiliziraju jednolančanu DNA, tzv. SSB-proteini (engl. single-stranded binding proteins) (tablica 10.1.).

Tablica 10.1. Enzimi koji sudjeluju u replikaciji DNA prokariota

Kod eukariota je poznato 14 vrsta DNA-polimeraza od kojih je 5 ključno za replikaciju, a nazivamo ih pol α, pol β, pol γ, pol δ, and pol ε.

Odmotavanje pojedinih regija dvostruke uzvojnice na replikacijskim vilicama utječe na cijeli kromosom (i prokariotski i eukariotski). Kromosom se prilagođava novonastaloj situaciji dodatnim namotavanjem DNA-molekule što nazivamo superzavojitost (engl. supercoiling). Kretanje replikacijskih vilica u oba smjera (dvosmjerno, engl. bidirectional) uzrokuje sve više superzavoja. Superzavojitost bez kontrole može nepovoljno utjecati na process replikacije. Grupa enzima DNA-topoizomeraze pomaže relaksiranju superzavojitosti zarezujući jedan ili oba lanca DNA. U tablici 10.2. prikazane su razlike između replikacije kod prokariota i eukariota.

Tablica 10.2. Razlike između replikacije prokariotske i eukariotske stanice

Svaka stanica mora osigurati preciznost genetske informacije prije, za vrijeme i nakon replikacije. Genetska informacija čuva svoj integritet kako bi se spriječile i najmanje greške što bi moglo biti pogubno za organizam. Integritet se održava viškom informacije (vidi poglavlje genski kod), enzimima za popravak oštećene DNA i preciznošću stanične replikacijske mašinerije.