Uvod

Do 1940-tih godina prošlog stoljeća prevladavalo je mišljenje da su proteini molekule nasljednog materijala zbog velike raznolikosti u njihovoj strukturi. Međutim proteini nisu samoreplicirajuće strukture, a nisu niti stabilni jer se neprestano sintetiziraju i razgrađuju unutar stanice. Drugi potencijalni kandidat za nasljedni materijal je bila nukleinska kiselina koja se nalazi u jezgri stanice. Johann Friedrich Miescher je 1871. g. izolirao tu makromolekulu iz jezgre bijelih krvnih stanica i spermija lososa i nazvao ju nuklein. R. Altman je to nazvao nukleinska kiselina jer je analizom otkrio da ta molekula sadrži šećer i dušikove baze. Dvije su vrste nukleinskih kiselina: deoksiribonukleinska (DNA) i ribonukleinska kiselina (RNA). Nuklein je DNA.

Feulgen je 1937. g. bojanjem kiselim fuksinom pokazao da je većina DNA smještena u jezgri eukariotske stanice. U to vrijeme istraživači nisu shvaćali na koji bi način DNA, molekula vrlo jednostavne strukture mogla zadovoljiti sve odlike potrebne genetskom materijalu.
No eksperimenti koji slijede dokazali su da je upravo molekula DNA genetski materijal.

Griffith je radio pokuse s bakterijom Diplococcus pneumoniae koja kod miševa uzrokuje upalu pluća.  Postoje 2 soja: S (engl. smooth = glatko) – glatki virulentan soj čije stanice imaju kapsulu pa na agarskoj ploči bakterije daju sjajne glatke kolonije i R (engl. rough = hrapavo) – nevirulentan hrapavi soj koji na agarskoj ploči daje granularne kolonije. Griffith je otkrio princip transformacije što je promjena fenotipa uzrokovana unošenjem stranog genetskog materijala u stanicu. Naime kada je Griffith toplinom ubio virulente S-stanice te ih miješao sa živim stanicama R-soja, nakon iniciranja te mješavine miševima, oni su obolijevali od upale pluća i ugibali. Griffith je pretpostavljao da je „nešto“ preživjelo u toplinom ubijenim S-stanicama i prešlo u žive R-stanice te ih transformiralo tako da su postale patogene.

To je bila molekula DNA, što su kasnije dokazali istraživači Avery, McCarty i MacLeod s Rockfellerovog Instituta (1944.). Oni su izolirali i pročistili sve glavne kemijske sastojke virulentnih bakterija i testirali ih na mogućnost transformacije ukoliko se pomiješaju s nevirulentnim R-sojem. Samo fragmenti molekule DNA su mogli transformirati R-stanice, a sposobnost transformacije nije bila uništena enzimima koji razgrađuju proteine (proteaze) ili molekulu RNA (ribonukleaza ili RNA-aza). S duge strane izlaganje deoksiribonukleazi (DNA-aza) uzrokovalo je gubitak sposobnosti transformacije tj. razgradnju molekula DNA.

Hershey i Chase su radili istraživanja s bakteriofagom T2 koji napada bakteriju E. coli i koristi je kao domaćina za razmnožavanje. Fagi su bakterijski virusi (bakteriofagi) vrlo jednostavne strukture (proteinski omotač i DNA) te su stoga idealni objekti za dokazivanje genetskog materijala. Hershey i Chase su obilježili proteine faga radioaktivnim sumporom (³⁵S), a molekulu DNA radioaktivnim fosforom (³²P) i na taj je način bilo moguće pratiti te molekule tijekom životnog ciklusa faga, infekciju i razmnožavanje. Kada su jednu grupu faga uzgajali na radioaktivnom sumporu, te ih pomiješali s bakterijama, nove čestice virusa nakon liziranja bakterijskih stanica imale su radioaktivni omotač. To je bila potvrda da se radioaktivni sumpor nalazi u proteinskom omotaču faga. Druga grupa faga je rasla na radioaktivnom fosforu. Nakon zaražavanja bakterija i lize, nove čestice faga imale su DNA obilježenu radioaktivnim fosforom. Budući da fag prilikom infekcije bakterije u nju ispušta svoju DNA, a proteini ostaju na površini bakterije ovim jednostavnim eksperimentom su dokazali da je DNA genetski materijal (slika 10.1.)

1950-tih godina prošloga stoljeća mnogo je istraživača radilo na otkrivanju strukture DNA: Linus Pauling (California Institute of Technology, Pasadena), Maurice Wilkins i Rosalind Franklin (King’s College, London), James Watson i Francis Crick (Cavendish Laboratory, Cambridge). Velika pomoć u otkrivanju strukture bile su Chargaffova kemijska analiza i rendgentska kristalografija DNA koju je radila Rosalind Franklin.

Erwin Charrgaff je (od 1949. do 1953.) proveo niz eksperimenata u kojima je analizirao sastav baza molekula DNA izoliranih iz različitih vrsta te pokazao da je broj baza adenina (purinska baza) uvijek jednak broju baza timina (pirimidinska baza); odnosno broj gvanina (purinska baza) jednak je broju citozina (pirimidinska baza). Njemu u čast to nazivamo Chargaffovo pravilo. Sastav baza je karakteristika vrste, a svaka vrsta ima specifični omjer A+T: G+C parova baza. To se najčešće izražava kao % AT (količina A+T) i % GC (količina G+C).

Npr. 40 % GC znači: 20 % gvanina i 20 % citozina; a ostatak od 60 % čini 30 % adenina i 30 % timina.

Postotak GC u organizmima na nižem stupnju razvitka (prokarioti) pokazuje veću varijabilnost između vrsta (npr. 25 % u jedne vrste, 75 % u druge). A s evolucijskim napretkom sve je manje varijabilnosti pa je tako kod sisavaca % GC oko 40.