Supstitucija je zamjena baze jednog nukleotida drugom. Zamjena jedne purinske baze drugom bazom (npr. A u G) je tranzicija, a zamjena purinske baze pirimidinskom je transverzija. Zamjena trećeg slova tripleta genskog koda (odnosno kodona) najčešće nema utjecaja na primarnu strukturu (redoslijed aminokiselina) polipeptidnog lanca pa takvu mutaciju još nazivamo istovjetna (engl. samesense) ili tiha.
VAŽNO JE ZNATI
Spontane i inducirane mutacije imaju istu molekularnu osnovu: mogu nastati supstitucijom, insercijom ili delecijom nukleotida.
Razlog tomu je degeneriranost genskoga koda koji ima puno više tripleta (64; slika 13.3.a.) nego što je potrebno za 20 aminokiselina koje grade proteine. Ukoliko dođe do zamjene prvog ili drugog slova koda (odnosno kodona) posljedice za organizam mogu biti ozbiljne jer nastaju pogrešne mutacije (engl. missense, slika 13.3.b.) čija je posljedica zamjena aminokiselina, odnosno promjena strukture i funkcije proteina. Primjerice pogrešna mutacija u genu za sintezu β- hemoglobina uzrokuje tešku nasljednu bolest srpastu anemiju zbog zamjene jedne aminokiseline drugom (Glu u Val).
Slika 13.3.a. Genski kod u obliku mRNA kodona.
Slika 13.3.b. Vrste mutacija (crtež Renata Horvat).
Sustitucijom nastaju i besmislene mutacije (engl. nonsense) koje uzrokuju prestanak biosinteze proteina (slika 13.3.b., tablica 13.1.).
Tablica 13.1. Vrste mutacija koje nastaju supstitucijom.
Eritrociti osoba koje imaju srpastu anemiju (genotip HbSHbS) su srpastog oblika (slika 13.4.), te se sljepljuju i začepljuju krvne žile što ima za posljedicu mnogobrojne fenotipske učinke (pleiotropni učinak gena). Kod heterozigota (HbAHbS) koji su zdravi u krvi se nalaze i normalni diskoidni i srpasti eritrociti (kodominantni odnos alela) (slika 13.5.).
|
Divlji tip mRNA AUG AAG UUU GGC Protein Met – Lys – Phe – Gly |
|
|
ISTOVJETNA (TIHA) MUTACIJA |
mRNA AUG AAG UUU GGU Protein Met – Lys – Phe – Gly |
| POGREŠNA MUTACIJA | mRNA AUG AAG UUU AGC Protein Met – Lys – Phe – Ser |
| BESMISLENA (prerani završetak translacije) | mRNA AUG UAG UUU GGC Protein Met-STOP KODON |
Slika 13.4. Normalni oblik eritrocita (slika gore) i srpasti eritrociti (slika dolje) (izvor: The National Heart, Lung, and Blood Institute (NHLBI) – http://www.nhlbi.nih.gov/health/health-topics/topics/sca/, Public Domain, https://commons.wikimedia.org/w/index.php?curid=19198765).
Slika 13.5. Srpasti eritrociti (jedan označen crvenom crtom) i normalni eritrociti u uzorku krvi heterozigota HbAHbS(izvor: By Dr Graham Beards – Own work, CC BY-SA 3.0, https://commons.wikimedia.org/w/index.php?curid=18421017).
Insercija (adicija) je umetanje jednog ili više nukleotida; delecija je gubitak jednog ili više nukleotida. Insercija i delecija uzrokuju mutaciju pomaka okvira čitanja (engl. frameshift). Okvir čitanja je način na koji ribosom krećući se po mRNA čita poruku zapisanu u kodonima te ju prevodi u aminokiselinski slijed proteina (tablica 13.2.). Insercijom ili delecijom tri nukleotida ne dolazi do mutacije pomaka okvira čitanja.
Tablica 13.2. Mehanizam nastanka mutacije pomaka okvira čitanja.
|
Divlji tip mRNA AUG AAG UUU GGC U |
Mutacija pomaka okvira čitanja (“frame-shift”) nastala delecijom jednog (trećeg) nukleotida (U) mRNA AUG AAG UUG GCU Protein Met – Lys – Leu – Ala
|
|
Divlji tip mRNA AUG AAG UUU GGC U Protein Met – Lys – Phe – Gly
|
Mutacija pomaka okvira čitanja (“frame-shift”) nastala insercijom jednog nukleotida (U) mRNA AUG UAA GUU GGCU AA Proten Met – STOP KODON |
Pogrešna mutacija koja nema učinak na funkciju proteina je neutralna mutacija.
Mutacije normalnog (dominantnog) divljeg tipa alela: A—-a – recesivna mutacija. Povratna mutacija vraća mutantni recesivni alel u dominantni alel divljeg tipa: a—–A. Povratne mutacije se događaju vrlo rijetko.
Drugi način za opisivanje mutacije je njezin učinak na fenotip divljega tipa. Već spomenute neutralne mutacije ne mijenjaju funkciju proteina pa tako ne utječu na preživljavanje i razmnožavanje jedinke. Štetna mutacija utječe na preživljavanje i mogućnost razmnožavanja. Ekstremni primjer takve mutacije je letalna mutacija koja uzrokuje smrt jedinke.
Postoje i tzv. korisne mutacije koje povećavaju stopu preživljavanja i razmnožavanja. Neke mutacije nazivamo kondicionalne jer na fenotip utječu samo u određenim okolišnim uvjetima (česte kod mikroorganizama).
Kada dođe do mutacije u sekvenciji gena, postoji nekoliko putova za opstanak jedinke:
Jednostavna povratna mutacija (reverzija) – ili povratak na staro.
Intragenska supresija – unutar sekvencije jednoga gena dolazi do dvije mutacije (adicije i delecije); druga mutacija u istom genu maskira pojavu originalne mutacije; rezultat je dvostruka mutanta koja ima originalni fenotip.
Intergenska supresija – povratak funkcije mutiranoga gena promjenom drugoga gena kojeg nazivamo supresorski gen. Supresorski geni su najčešće geni za tRNA (transfer). Kada mutiraju, supresorske mutante mijenjaju način na koji se čita i prevodi kodon. Npr. tRNA koju stvara supresorska mutanta čita stop kodon kao kodon za neku aminokiselinu, tako da nema prestanka translacije. Primjerice kod bakterije E. coli postoje najmanje tri supresorske mutante za stop kodon UAG.
U genomu postoje i tzv. mutatorske i antimutatorske mutacije koje povećavaju ili smanjuju stopu mutacije u stanici. To su najčešće mutacije DNA-polimeraze i to njene egzonukleazne aktivnosti (korekcija krivo sparene baze njezinim izrezivanjem).
Mutacije u haploidnom organizmu lako se otkrivaju jer se sve (i dominantne i recesivne) eksprimiraju u fenotipu. Za detekciju mutacija u bakterija vrlo je djelotvorna tehnika otiska (engl. replica-plating).
Slika 13.6. “Replica plating” tehnika za detekciju otpornosti na antibiotike u bakterija (crtež Renata Horvat).
U diploidom organizmu će se dominantna mutacija u gameti pojaviti u fenotipu potomstva, dok recesivna mutacija neće biti vidljiva u prvoj generaciji potomaka ukoliko nije spolno-vezana.
Bakterijskim testovima može se detektiratii mutageni potencijal neke kemikalije. Najpoznatiji i najčešće upotrebljavani test je Amesov test (Bruce Ames, 1973.). Bakterijski testovi razlikuju karcinogene od nekarcinogena s vrlo velikom preciznošću (oko 90 %), ekonomičniji su od testova na životinjama, daju rezultate u kratkom periodu (2 dana), a mogu otkriti i slabe karcinogene.
Kada se supstanca okarakterizira potencijalnim mutagenom pomoću Amesovog testa, njezin mutageni (karcinogeni) potencijal istražuje se dalje na sisavcima.
Osnova Amesovog testa je detekcija genske mutacije koja se javlja kao odgovor na djelovanje neke supstance. Test koristi bakteriju Salmonella typhimurium koja nosi mutaciju u genu za sintezu histidina, auksotrof je za histidin (genotip his–). His–-sojevi nose supstituciju baza (tranzicija ili transverzija) ili mutaciju pomaka okvira čitanja. Sposobnost neke kemikalije da izazove povratnu mutaciju (his– u his+) uzima se kao njen mutageni, odnosno karcinogeni potencijal (slika 13.7.). U testu se uvijek koristi više koncentracija (najmanje tri) potencijalnog mutagena te se broj revertanata (frekvencija mutacija) analizira statistički i ukoliko se detektira statistički značajna razlika između tretiranog uzorka i negativne kontrole supstanca je mutagena. His–-sojevi također imaju mutaciju koja uzrokuje defekt u mehanizmu popravka DNA, te mutaciju koja čini stijenku bakterije propusnijom za kemikalije.
Nisu svi mutageni istovremeno i karcinogeni, ali je korelacija vrlo visoka. Ako je neka supstanca mutagena vjerojatnost da je i karcinogena je 90 %.
Kako bi rezultati Amesovog testa bili primjenjivi i na eukariotske organizme u testu se koristi izolat jetre štakora (tzv. frakcija S9) koji sadrži enzime za biotransformaciju. Naime nisu sve supstance karcinogene, ali neke metaboliziranjem u jetri to postaju. S druge strane neke toksične i potencijalno karcinogene supstance u jetri se detoksificiraju te više nisu opasne za organizam. Enzimi jetre štakora djeluju jednako kao i enzimi jetre čovjeka pretvarajući nekarcinogene supstance u potencijalne karcinogene (ili obrnuto). Stoga je pozitivan rezultat djelovanja (mutagenost) neke kemijske supstance dobiven Amesovim testom primjenjiv i na stanice eukariota.
Slika 13.7. Princip izvođenja Amesovog testa (crtež Renata Horvat).