Tehnologija rekombinantne DNA predstavlja niz molekularno-genetičkih metoda uz pomoć kojih je moguće mijenjati nasljednu tvar stanice. Razdoblje rekombinantne DNA tehnologije započelo je otkrićem restrikcijskih enzima, 70.-tih godina prošlog stoljeća, a 1978. dodijeljena je Nobelova nagrada za fiziologiju i medicinu W. Arberu, H. Smithu i D. Nathansu za njihov rad na otkriću restrikcijskih enzima (endonukleaza). Restrikcijske endonukleaze su enzimi koje bakterijska stanica koristi za razgradnju strane DNA (virusna DNA). Enzim prepoznaje određenu nukleotidnu sekvenciju tzv. restrikcijsko mjesto od 4 do 8 nukleotidnih parova baza, te cijepa na tom mjestu (ili u neposrednoj blizini) dvolančanu DNA. DNA bakterijske stanice ima ista restrikcijska mjesta kao i virusna DNA, no ta su mjesta zaštićena od cijepanja jer su metilirana.
Restrikcijske endonukleaze razlikujemo prema vrsti sekvencije koju prepoznaju, prirodi cijepanja DNA i strukturi enzima. Najpogodnije su restrikcijske endonukleaze koje prepoznaju točno određena restrikcijska mjesta. Radi se o obrnuto ponavljajućim sekvencijama ili palindromima (čitaju se isto i slijeve i s desne strane npr. 5’ GGATCC 3’ – 3’ CCTAGG 5’ vidi sliku 20.4.).
Nakon cijepanja tih mjesta restrikcijski enzimi ostavljaju ljepljive ili kohezivne krajeve (slika 20.4.) i tupe krajeve. Istraživači najčešće koriste restrikcijske enzime koji stvaraju ljepljive krajeve jer to čini kloniranje tehnički puno jednostavnijim. Kada se dvije dvolančane molekule DNA pocijepaju istim restrikcijskim enzimom koji ostavlja ljepljive krajeve, miješanjem fragmenata nakon restrikcije dolazi do povezivanja jednolančanih ljepljivih krajeva vodikovim vezama između komplementarnih baza.
Restrikcijski enzimi dobivaju ime prema vrsti i soju bakterije iz koje su izolirani; primjerice BamH1: Bacillus amyloliquefaciens soj H1 (slika 20.4.). Do danas je identificirano više od 3500 restrikcijskih enzima, od kojih je njih više od 250 komercijalno dostupno istraživačima.
Slika 20.4. Restrikcijska endonukleaza BamH1 nakon cijepanja ostavlja jednolančane ljepljive ili kohezivne krajeve (crtež Renata Horvat).
Tehnologija rekombinantne DNA bazira se na ugradnji stranog gena u genom prokariotske ili eukariotske stanice. To se radi uz pomoć plazmida ili faga (bakteriofag ili bakterijski virus) koje nazivamo vektorima (lat. vect = nošen). To je tzv. molekularno kloniranje.
Postupak se sastoji od izolacije strane DNA te izrezivanja željenog fragmenta (npr. sekvencija gena) i vektorske DNA pomoću istog restrikcijskog enzima, te ugradnje strane DNA u vektorsku DNA (uz pomoć enzima ligaze) (slike 20.5. i 20.6.). Vektor sa ugrađenom stranom DNA je rekombinantni vektor.
Slika 20.5. Ubacivanjem stranog gena u plazmidnu DNA nastaje rekombinantna DNA (crtež Renata Horvat).
Slika 20.6. Stvaranje rekombinantnog plazmida (crtež Renata Horvat).
Vektor se zatim ubacuje u stanicu domaćina gdje se umnožava stvarajući mnogobrojne kopije strane DNA. Geni strane DNA koji su ugrađeni u vektor mogu se prepisati i prevesti u željeni polipeptidni produkt (slika 20.7.).
Kao stanica domaćin najčešće se koristi bakterija E. coli u koju se unose vektori sa primjerice ljudskim genima čijom ekspresijom nastaju proteini. Takve genetički modificirane bakterije koriste se za proizvodnju lijekova (npr. antibiotici, inzulin i dr.), cjepiva i drugih supstancija za liječenje te za istraživanja. Prvi lijek dobiven tehnologijom rekombinantne DNA je bio inzulin kada je 1982.g. Američka agencija za hranu i lijekove dala dozvolu za njegovu proizvodnju.
Slika 20.7.Ubacivanje ljudskog gena u plazmidnu DNA; rekombinantni plazmid umnožava se u bakterijskoj stanici te se u određenom trenutku strani gen prepisuje i prevodi u polipeptidni produkt (crtež Renata Horvat).
Genetički modificirane bakterije se također mogu upotrebljavati za čišćenje okoliša od zagađivača, za obogaćivanje tla, za ubijanje kukaca nametnika, za otkrivanje minskih polja itd.
S obzirom na vrstu molekule DNA (dvolančana kružna, linearna), veličinu strane DNA te stanicu domaćina razlikujemo različite vektore: plazmid, bakteriofag lambda, kozmid, bakteriofag P1, BAC (engl. bacterial artificial chromosome), YAC (od engl. yeast artificial chromosome).
Primjer prokariotskog vektora je kozmid, to je dvolančana DNA sa cos-mjestima. Cos-mjesta nalazimo u genomu faga lambda i to je jednolančana DNA od 12 baza na oba kraja dvolančane linearne molekule DNA. To su kohezivni ili ljepljivi krajevi (slika 20.8.). Kozmidi se prenose u bakterijsku stanicu uz pomoć bakteriofaga lambda. U glavi faga molekula DNA je linearna, a kada uđe u stanicu domaćina onda postane kružna sljepljivanjem kohezivnih krajeva. Kozmidi dozvoljavaju kloniranje velikih dijelova DNA (30-45 kb) jer se mali kozmidi ne mogu upakirati u glavu faga.
Slika 20.8. Kozmid, plazmid sa cos mjestima i ugrađenim stranim genom prenosi se u bakteriju preko bakteriofaga l (crtež Renata Horvat).
Ponekad u prokariotskoj stanici nije moguće potpuno eksprimirati neke eukariotske gene jer prokariotska stanica nema enzime za postranskripcijsku i posttranslacijsku modifikaciju. Tada se se koriste eukariotski vektori. Stanica kvasca (jednostanični eukariot), Saccharomyces cerevisiae, ima plazmid koji se može koristi za unos eukariotskih gena kao YAC vektor. To se radi na sljedeći način: konstruira se bakterijski plazmid sa CEN-regijom (kvaščeva centromerna regija) i izvorom replikacije kvaščeve i bakterijske DNA, genom za rezistentnost na antibiotik i telomernom sekvencijom kromosoma kvasca.
Tako konstruirani plazmid je YAC (engl. Yeast Artificial Chromosome) ili umjetni kromosom kvasca. YAC može nositi veliki dio strane DNA (250 – 2000 kb i više što je vrlo pogodno upravo za eukariotske gene) koja se replicira i prenosi iz generacije u generaciju u stanici kvasca (slika 20.9.).
Slika 20.9. Konstruiranje YAC vektora: E. coli plazmid pBR322 modificiran za kvasce može se replicirati i u stanici kvasca i u E. coli jer ima oba izvora replikacije te CEN regiju. Ako se kružna molekula pocijepa te se na krajeve dodaju telomerne sekvencije nastaje umjetni kromosom kvasca (YAC) koji se koristi za kloniranje velikih dijelova DNA (crtež Renata Horvat).
Plazmidi BAC (engl. bacterial artificial chromosomes) i PAC (engl. P1 artificial chromosomes) su noviji tipovi vektora za kloniranje. Plazmidi BAC su razvijeni iz bakterijskih F-plazmida, a plazmidi PAC iz P1-bakteriofaga. Ovi se vektori lakše koriste od vektora YAC jer su prstenaste molekule koje se sa insertima (strana DNA) ubacuju u bakteriju E. coli i tamo repliciraju, a mogu klonirati velike fragmente DNA (300 kb i više).
VAŽNO JE ZNATI
Selekcija rekombinantnog vektora radi se uz pomoć selektivnih podloga s antibiotikom (slika 20.10.), jer se koristi svojstvo rezistentnosti na antibiotik, a gen za rezistentnost dio je plazmidne DNA.
Primjerice gen ampR kodira enzim β-laktamazu koja razgrađuje antibiotik ampicillin, te bakterija toga genotipa može rasti na podlozi s tim antibiotikom.
Selekcija se također može raditi i sa genom za protein koji daje neki vidljivi produkt, npr. boja ili fluorescencija. Primjer je plavo-bijela selekcija gdje se kao vektor koristi plazmid sa lacZ genom unutar kojega se nalazi više mjesta za kloniranje. Gen lacZ kodira za enzim β-galaktozidazu koja cijepa laktozu na glukozu i galaktozu (vidi poglavlje 15). Ako je strana DNA inkorporirana na neko od klonirajućih mjesta gena lacZ, gen neće biti funkcionalan i neće stvarati funkcionalne kopije enzima β-galaktozidaze. Kad se bakterije nacijepe na selektivnu podlogu sa antibiotikom ampicilinom samo će transformirane bakterije rasti. U toj podlozi se nalazi i supstanca X-gal koja je strukturom slična laktozi i supstrat je za β-galaktozidazu. Bakterijske stanice koje nisu transformirane (plazmid nema stranu DNA) imaju funkcionalan gen lacZ koji stvara β-galaktozidazu, a ona cijepa X-gal u podlozi te nastaje plava boja. Rekombinantne bakterije sa plazmidom u koji je ugrađena strana DNA unutar gena lacZ stvorit će bijele kolonije na X-gal podlozi jer nema β-galaktozidaze. Bijele kolonije su genetski identične stanice (klon) sa kopijama rekombinantnog plazmida. Bijele kolonije se nakon selekcije mogu presaditi na podlogu za uzgoj velikog broja rekombinantnih stanica iz kojih se onda relativno jednostavno mogu izolirati i pročistiti rekombinantni plazmidi.
Slika 20.10. Selekcija hibridnog (rekombinantnog) vektora radi se na selektivnoj podlozi s antibiotikom ampicilinom jer vektor ima gen za rezistentnost ampr. U drugom genu za rezistentnost tetR nalazi se restrikcijsko mjesto BamHI u koje se uklonira strana DNA te se gubi resistentnost na tetraciklin (crtež Renata Horvat).